IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside) ass en Analog vum β-galactosidase Substrat, deen héich inducibel ass.Ënnert der Induktioun vum IPTG kann den Induktor e Komplex mam Repressorprotein bilden, sou datt d'Konformatioun vum Repressorprotein geännert gëtt, sou datt et net mat dem Zilgen kombinéiert ka ginn, an den Zilgen effizient ausgedréckt gëtt.Also wéi soll d'Konzentratioun vun IPTG während dem Experiment bestëmmt ginn?Ass wat méi grouss, wat besser?
Als éischt, loosst eis de Prinzip vun der IPTG Induktioun verstoen: E. coli's Laktoseoperon (Element) enthält dräi strukturell Genen, Z, Y, an A, déi β-Galaktosidase, Permease an Acetyltransferase codéieren, respektiv.lacZ hydrolyséiert Laktose a Glukos a Galaktose, oder an Allolaktose;lacY léisst Laktose an der Ëmwelt duerch d'Zellmembran passéieren an an d'Zelle kommen;lacA transferéiert d'Acetylgrupp vun Acetyl-CoA op β-Galaktosid, wat d'Entfernung vum Toxesche Effekt involvéiert.Ausserdeem gëtt et eng Operatiounssequenz O, eng Startsequenz P an e Reguléierungsgen I. Den I Gencode ass e Repressorprotein, deen un d'Positioun O vun der Operator Sequenz binde kann, sou datt den Operon (Meta) ënnerdréckt an ausgeschalt.Et gëtt och e Bindungsplaz fir katabolescht Genaktivator Protein-CAP Bindungsplaz upstream vun der initiéierender Sequenz P. D'P Sequenz, O Sequenz an CAP Bindungsplaz bilden zesummen d'Reguléierungsregioun vum Lac Operon.D'Kodéierungsgenen vun den dräi Enzyme gi vun der selwechter Reguléierungsregioun geregelt fir de koordinéierten Ausdrock vun Genprodukter z'erreechen.
Beim Fehlen vu Laktose ass de Lac Operon (Meta) an engem Zoustand vun der Repressioun.Zu dëser Zäit bindt de Lac-Repressor, deen duerch d'I Sequenz ënner der Kontroll vun der PI Promoteur Sequenz ausgedréckt gëtt, un d'O Sequenz, wat verhënnert datt d'RNA Polymerase sech un d'P Sequenz bindet an d'Transkriptiounsinitiatioun hemmt;wann Laktose präsent ass, kann de Lac Operon (Meta) induzéiert ginn An dësem Operon (Meta) System ass de richtegen Induktor net Laktose selwer.Laktose kënnt an d'Zelle a gëtt duerch β-Galaktosidase katalyséiert fir an Allolaktose ëmgewandelt ze ginn.Déi lescht, als Induktormolekül, bindt sech un de Repressorprotein a ännert d'Proteinkonformatioun, wat zu der Dissoziatioun vum Repressorprotein aus der O Sequenz an der Transkriptioun féiert.Isopropylthiogalactoside (IPTG) huet deeselwechten Effekt wéi Allolaktose.Et ass e ganz mächtege Induktor, deen net vu Bakterien metaboliséiert gëtt a ganz stabil ass, sou datt et vill an Laboratoiren benotzt gëtt.
Wéi bestëmmen déi optimal Konzentratioun vun IPTG?Huelt E. coli als Beispill.
Den E. coli BL21 genetesch manipuléierte Stamm, deen de positiven rekombinante pGEX (CGRP /msCT) enthält, gouf an LB flësseg Medium mat 50μg · ml-1 Amp inokuléiert an iwwer Nuecht bei 37 ° C kultivéiert.Déi uewe genannte Kultur gouf an 10 Fläschen vu 50mL frësche LB flëssege Medium mat 50μg · mL-1 Amp an engem Verhältnis vun 1:100 fir Expansiounskultur inokuléiert, a wann den OD600 Wäert 0,6 ~ 0,8 war, gouf IPTG zu der Finale Konzentratioun bäigefüügt.Et ass 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmol·L-1.No der Induktioun bei der selwechter Temperatur an der selwechter Zäit gouf 1 ml vun der bakterieller Léisung dovun geholl, an d'Bakterienzelle goufen duerch Zentrifugéierung gesammelt an op SDS-PAGE ënnerworf fir den Afloss vu verschiddenen IPTG Konzentratioune op Proteinausdrock ze analyséieren, an dann wielt d'IPTG Konzentratioun mat de gréisste Protein Ausdrock.
No Experimenter gëtt et festgestallt datt d'Konzentratioun vu IPTG net sou grouss wéi méiglech ass.Dëst ass well IPTG eng gewësse Toxizitéit fir Bakterien huet.Iwwerschreiden d'Konzentratioun wäert och d'Zelle ëmbréngen;an allgemeng geschwat, mir hoffen, datt de méi soluble Protein an der Zell ausgedréckt, besser, mä a ville Fäll, wann d'Konzentratioun vun IPTG ze héich ass, gëtt eng grouss Quantitéit vun Inclusioun geformt.Kierper, awer d'Quantitéit vum soluble Protein ass erofgaang.Dofir ass déi gëeegentste IPTG Konzentratioun dacks net wat méi grouss ass, wat besser, awer wat méi niddereg d'Konzentratioun ass.
Den Zweck vun der Induktioun an der Kultivatioun vun genetesch manipuléierte Stämme ass d'Ausbezuele vum Zilprotein ze erhéijen an d'Käschte ze reduzéieren.Den Ausdrock vum Zilgen ass net nëmme vun den eegene Faktoren vum Stamm an dem Ausdrockplasmid beaflosst, awer och vun aneren externe Bedéngungen, wéi d'Konzentratioun vum Induktor, d'Induktiounstemperatur an d'Induktiounszäit.Dofir, am Allgemengen, ier en onbekannt Protein ausgedréckt a gereinegt gëtt, ass et am beschten d'Induktiounszäit, d'Temperatur an d'IPTG Konzentratioun ze studéieren fir déi entspriechend Konditiounen ze wielen an déi bescht experimentell Resultater ze kréien.
Post Zäit: Dez-31-2021